미국으로 이민 온 독일계 유대인 가정에서, 1874년 펜실베이니아의 앨러게니에서 태어나 1946년 프랑스 파리 근교 인 뇌유쉬르센에 있는 미국 병원에서 72살에 죽었다. 그녀는 시인, 작가, 극작가, 번역가 및 예술품 수집가로 불리며 또한 매우 중요한 미국의 여성주의자로도 언급된다.

래드클리프대학 재학 중 교수 윌리엄 제임스의 권유로 1897년 존스홉킨스 의과대학에 입학한다. 이 시기에 만난 페미니스트 정치활동가이자 편집자였던 메리 북스테이버Mary Bookstaver와의 관계는 첫 번째 책 『Q.E.D.』(1903)의 기초가 되었고, 세 편으로 묶인 『세 명의 삶Three Lives』(1909) 가운데 중편 「멜란차Melanctha」에는 두 사람의 관계가 이성애로 표현되었다. 1903년 파리로 이주한 거트루드 스타인은 플뢰뤼스 27번지에서 살며 예술가들을 위한 살롱을 열었다. 앙리 마티스와 파블로 피카소의 작품을 처음으로 구입하고, 헤밍웨이와 피츠제럴드, 조이스, 엘리엇 등 미국의 예술가들과도 깊게 교류하는 등 예술가들의 후원자이자 예술품 수집가로 영향을 끼친다.

1907년 살롱을 방문한 앨리스 바벳 토클라스(Alice Babette Toklas)와 사랑에 빠져 평생의 동반자가 된다. 1930년 연인 앨리스 B. 토클라스와 ‘플레인에디션’ 출판사를 설립해 작가와 편집자로 활동한다. 1933년, 살롱에서 만난 예술가들의 이야기와 그들의 삶을 엮은 『앨리스 B. 토클라스의 자서전The Autobiography of Alice B. Toklas』을 발표해 유럽 문화를 궁금해하던 미국인들에게 큰 반향을 일으킨다.

20세기 중후반의 가장 놀랄만한 미국 여성 예술품 수집가인 페기 구겐하임Peggy Guggenheim도 거트루드 스타인이 자신의 길을 인도했던 본보기였다고 밝힌 바가 있듯이 20세기 초반에 야수파와 입체주의 화가들을 누구보다 앞서 높이 인정하며 격려한 점과 청년 작가들에게는 ‘잃어버린 세대’라고 신랄한 비평을 서슴지 않으면서 엄격한 습작 훈련을 요구했던 그녀야말로 유럽의 문단과 화단에서 가장 영향력 있는 대모였다는데는 어느 누구도 부정할 수 없는 명백한 사실이다. 그 외에도 시집 『부드러운 단추Tender Buttons』(1914), 장편소설 『미국인의 형성The Making of Americans』(1925) 등을 통해 독특한 작품 세계를 보여주었다. 1946년, 벨기에 여행 이후 위암으로 건강이 악화되어 사망했다. 스타인이 남긴 유산은 가족들의 반대로 동반자 앨리스에게 돌아가지 못했다. 1967년 3월 사망한 앨리스는 거트루드 스타인이 묻힌 파리의 페르라세즈 공동묘지에 함께 묻혔다.

그녀의 주요 작품은 『세 인생(Three Lives)』, 1909년 『부드러운 단추』, 1914년 『지리와 희곡』, 1922년 『미국인의 형성』, 1925년 『작문과 해설』, 1926년 『상냥한 루시 쳐치』, 1931년 『우정이라는 꽃이 시들기 전에, 우정은 끝났다네』, 1931년 『쓰기의 기술』, 1931년 『오페라와 연극』, 1932년 『앨리스 B. 토클라스의 자서전』, 1933년 『3막으로된 4인의 성인(聖人)』, 1934년 『마티스, 피카소 그리고 거트루드 스타인, 가장 짧은 두 편의 이야기』, 1933년 『누구나의 자서전』, 1937년 『아이다』, 1941년 『내가 본 전쟁』 등이 있으며 작곡가 버질 톰슨Virgil Thomson을 위해서 오페라 극본을 쓰기도 했다.